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    上海研域生物原代細胞技術實驗原理及傳代操作

    發(fā)布時間: 2025-01-07  點擊次數(shù): 524次

    在我們培養(yǎng)原代細胞的過程中,對細胞進行傳代是一項常規(guī)的操作,傳代可以幫助我們擴大細胞培養(yǎng)的數(shù)量,同時也避免了因細胞進入平臺期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。今天我們簡單講講傳代操作(主要針對貼壁細胞)。

    實驗原理:

    當培養(yǎng)的細胞增殖達到一定密度后,將會出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象,表現(xiàn)為細胞的生長和分裂速度逐漸減慢,甚至停止。貼壁細胞會在培養(yǎng)瓶中長成致密單層 (懸浮細胞會充滿整個體積的培養(yǎng)液),鋪滿培養(yǎng)瓶底部,此時如果不及時進行分裝再培養(yǎng),即傳代培養(yǎng),細胞將逐漸走向衰老、死亡,將培養(yǎng)的細胞從一個容器以適當比率轉移到其他容器中擴大培養(yǎng),稱為傳代培養(yǎng)。

    首先,我們需要準備好相應的實驗器材:裝有75%醫(yī)用消毒酒精的酒精噴壺、PBS緩沖液、胰酶、含血清培養(yǎng)基、巴氏吸管、移液器、離心管、廢液缸。至于其他的超凈臺、培養(yǎng)箱、離心機等都是一個細胞間的基礎設施。

    然后,我們需要把我們準備的器材放入超凈臺,打開紫外照射滅菌,值得注意的是若是培養(yǎng)的細胞對溫度比較敏感,可以將含血清的培養(yǎng)基瓶子(包括盛放胰酶的瓶子)放入37℃的水浴箱使得培養(yǎng)基溫度在37℃,再轉移到超凈臺紫外滅菌,當然一般的細胞對培養(yǎng)基的溫度不是很敏感,不用對培養(yǎng)基加溫也是可以的。另外,細胞培養(yǎng)間也需要紫外照射半小時左右。

    操作步驟:

    1、紫外照射滅菌后,我們應該穿好滅菌服,戴好滅菌手套和口罩。

    2、從培養(yǎng)箱取出細胞培養(yǎng)瓶(一般選擇處于對數(shù)期的細胞),用酒精噴壺在培養(yǎng)瓶表面噴灑75%酒精消毒,轉移培養(yǎng)瓶到超凈臺。

    3、打開蓋子,輕輕吸出舊的培養(yǎng)液,用巴氏吸管加入適量PBS緩沖液洗滌1-2次(注意從側壁加入,以免沖掉細胞),棄去PBS緩沖液。

    4、可用移液器加入1-2ml胰酶(具體量根據(jù)實驗需要確定,此處僅為參考用量),“十字"晃動,使胰酶充分接觸細胞。

    5、將加入胰酶的細胞培養(yǎng)瓶轉移到倒置顯微鏡載物臺,鏡下觀察細胞消化情況,當細胞變圓且大量脫落時,準備終止消化,用75%的酒精噴灑培養(yǎng)瓶表面,轉移到超凈臺。

    6、用移液器(或巴氏吸管)加入等量含血清培養(yǎng)基,終止消化。移液器(或巴氏吸管)充分吹打(動作也不要太猛,畢竟細胞也是蠻脆弱的),使細胞能夠脫落。

    7、將培養(yǎng)瓶中混合液體轉移至離心管中(離心管規(guī)格根據(jù)實驗需要確定),配平,離心5分鐘左右(離心機轉速根據(jù)細胞種類而定,常見的有1000rpm/min)

    8、離心好后,用酒精噴壺噴灑離心管表面,轉移進超凈臺,打開蓋子,將上清液倒入廢液缸。

    9、加入適量體積含血清培養(yǎng)基,用移液器或巴氏吸管輕輕吹打,制成細胞懸液。

    10、將細胞懸液分裝進2個(或多個)潔凈滅菌培養(yǎng)瓶,加入適量培養(yǎng)基,蓋好蓋子

    1、將分裝好的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡載物臺,觀察細胞情況,細胞應保證一定數(shù)量,數(shù)量太少會影響生長情況。

    12、在培養(yǎng)瓶上做標記,注明傳代時間,細胞種類,操作人員等信息。在放入培養(yǎng)箱之前應再次用酒精噴一噴培養(yǎng)瓶表面,然后應記得整理操作臺,用75%酒精擦拭超凈臺臺面,清理廢液和垃圾。

    注意,全程嚴格無菌操作!

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